1. Culture Cellulaire: Un outil pour la science

Comme toute science, la culture cellulaire fit ses premiers pas de manière très expérimentale, sans protocoles strictes et suivant plutôt l’intuition des chercheurs de l’époque. Au tournant du 20ème siècle, les premiers tissus animaux furent cultivés en les submergeant dans les fluides de tissus d’autres espèces animales. Certains virent que les cellules pouvaient proliférer dans ces conditions de culture et même être séparées pour être cultivées ailleurs. Cependant leur durée de vie était très limitée.

Aujourd’hui une très forte densité de cellules peut être obtenue grâce aux techniques modernes de culture cellulaire. Photo prise d’une cartouche à Fibres Creuses FiberCell Hollow Fibre

A partir des années 30, les scientifiques savaient isoler différentes lignées de cellules, tels que les fibroblastes et les cellules nerveuses. La courte durée de vie de ces cellules primaires ne permettaient pas aux scientifiques de les utiliser confortablement pour leurs recherches. Ils virent cependant qu’en disséquant ces cellules primaires de leur tissu d’origine, ils pouvaient alors les transférer sur une nouvelle surface en verre pour que celles-ci puissent continuer de grandir. Cette méthode de culture cellulaire nécessitait un repiquage constant. Le repiquage consiste à changer le milieu de culture cellulaire pour renourrir, éliminer les déchets cellulaires et réoxygéner la culture.

Le milieu de culture se composait essentiellement d’un mélange stable de solution saline avec des suppléments de sérum et du liquide d’ascite (souris). Les conditions d’hygiène en laboratoire de l’époque rendaient les manipulations extrêmement délicates et les contaminations étaient régulières.

La trypsine (enzyme digestive) fut ensuite découverte, permettant la séparation et dissociation des cellules de manière beaucoup plus rapide et efficace lors des repiquages. La dissection n’était plus nécessaire. Cela permit de réduire encore plus les risques de contamination lors de la culture cellulaire.

De nouvelles méthodes d’ultrafiltration découverte lors de la fin des années 30 permirent de grandement réduire le potentiel contaminateur de fluides venant de tissus animaux nécessaire à la nutrition des cellules. Puis des méthodes d’autoclavages (stérilisation par eau surchauffée) furent misent en pratique plus régulièrement. Tout ceci permit un avancement majeur dans la qualité et la fiabilité de la culture cellulaire.

Finalement la création de milieu chimiquement défini (glucose, acides aminés, vitamines et solution saline) eu un impact considérable sur le maintien et la reproductibilité des cultures cellulaires. Moins de sérum (très coûteux) était nécessaire à ajouter au milieu (passant de 50% à moins de 20%) enclanchant ainsi des prix plus abordables pour financer les recherches. La cryogénisation à -79 degrés donna lieu à un gain temps inestimable aux scientifiques car ils n’avaient plus besoin de repiquer les cellules pour maintenir les lignées en vie.

CDM-HD

Milieu de culture chimiquement défini par FiberCell Systems. Ce milieu de culture permet de remplacer l’utilisation de sérum animal et ainsi augmenter la pureté des produits cellulaires collectés

2. Principes Essentiels en Culture Cellulaire

a. Les bases de la culture cellulaire in vitro

Comme nous venons de l’expliquer la culture de tissus animaux remonte il y à plus de 100 ans grâce au pionniers Ross Harrison, Wilhelm Roux et Leo Loeb. Ces tissus furent cultivés sur des plaques de verre puis dans les années 40 dans les tous premiers flacons-T en verre créé par Wilton Earle. Il fut aussi le premier à développer un milieu de culture chimiquement défini et le premier à créer la première lignée continuelle de cellules, les cellules-L fibroblastes de souris. Une autre étape majeur qui émergea dans les années 50 fut la création des fameux milieux de culture MEM (Minimum Essential Medium) par Harry Eagle et le DMEM (Dulbeco’s Modified Eagle’s Medium) par Renato Dulbeco.

Aujourd’hui ces milieux de cultures sont toujours utilisés et les flacons-T, maintenant fait de plastique, sont omniprésent. Malgré leur faible coût, les flacons-T disparaîtront peu à peu et laisserons place à de nouvelles méthodes de culture cellulaire in vitro tel que les flacons EZ-Flask, les Plaques G-Rex et les sytèmes FiberCell Hollow Fibre Bioreactor.

b. Quelques lignées cellulaires importantes

La culture cellulaire ne serait rien sans la découverte et l’isolation des cellules HeLa, la première lignée humaine cultivée in vitro avec succès. Venant des cellules de Henrietta Lacks, une patiente atteinte d’un carcinome épidermoïde en 1955. Ses cellules sont les premières à avoir pu proliférer in vitro. Elles sont maintenant dans la plupart des laboratoires du monde entier.

Viennent ensuite les cellules CHO (Chinese Hamster Ovary cells) qui ont la capacité de proliférer dans du milieu de culture chimiquement défini sans sérum et en suspension, rendant ainsi la cultivation à grande échelle possible.

Bien sûr il existe une multitude d’autres lignées cellulaires importantes tels que HEK 293 (Human Embryonic Kidney cells), 3T3, WI-38, Jurkat …

c. La culture cellulaire animale: une variété d’applications

Domaine d’applicationExemples d’application
RechercheEtude de la physiologie cellulaire sous différentes conditions. Etude des mécanismes cellulaires des maladies, développement pharmaceutique, interactions entre cellules.
Industrie pharmaceutique et manufactureProduction de:

-Protéines: cytokines, insuline, interféron, interleukines, etc…

-Enzymes: trypsine, imiglucérase

-Acides Nucléiques: ADN, ARN, plasmides, etc…

-Anticorps monoclonaux

-Vaccins

Biocompatibilité et contrôle des médicamentsEvaluation de biocompatibilité in vitro de produits pharmaceutiques et nanoparticules.

Contrôle de médicaments:

-Molécules bioactives

Systèmes personnalisésCultivation et études de cellules tumorales isolées.
Thérapies cellulaires

Thérapie avec Récepteur antigénique chimérique

Les cellules souches mésenchymateuses

Conception de tissusConception de tissus osseux

Construction de cartilage

Greffes vasculaires


d) Les méthodes de stérilisation

Il n’y a pas de méthode universelle pour la stérilisation du matériel et de l’équipement utilisé pour la culture cellulaire. La méthode choisie doit être adaptée en fonction des propriétés des matériaux de l’équipement sélectionné. La stérilisation est définie comme toute suppression de bactéries, virus, champignons et spores venant d’objets contaminés.

Autoclavage (stérilisation à l’eau surchauffée): utilisée dans presque tous les laboratoires du monde. La stérilisation permet d’éliminer les agents contaminants en chauffant le matériel à l’eau surchauffée à une température de 121 degrés °C pendant une durée minimum de 30 minutes. Le seul désavantage de cette méthode est que son utilisation est réservé aux matériaux ‘résistant à l’autoclavage: TEFLON, verre, métal. Certains équipements plastiques peuvent être autoclavés mais leur durée de vie en sera réduite.

Irradiation (rayons Gamma et exposition aux rayons UV): Les contaminants sont détruits soit par une radiation ionisante (Gamma) ou non-ionisante (UV). Les rayons Gamma sont généralement utilisés pour la stérilisation des équipements plastiques nécessaire pour la culture cellulaire. L’irradiation par rayons Gamma se fait dans un établissement sécurisé et utilise la désintégration de Cobalt-60 où Césium-137 pour stériliser de manière ultra-pénétrante tout équipement. La stérilisation UV est moins chère mais est moins pénétrante que les rayons Gamma.

Ultra-Filtration: Tout liquide (milieu de culture cellulaire, antibiotiques, acides aminés, …) susceptible de changer de structure chimique lorsqu’il est chauffé ne peut pas être stérilisé par autoclavage. Ni par irradiation car cela détruirait les structures chimiques des composants liquides. Il faut donc recourir à l’ultra-filtration par membrane. Différents types de membranes existent avec des diamètres de pores variant de 0,1µm à 0,5µm.

Stérilisation chimique: L’utilisation de liquides tels que les alcools, les aldéhydes, et les halogènes ou bien certains gaz tels que l’oxyde d’éthylène et le formaldéhyde peuvent servir à la stérilisation d’équipements en agissant par dénaturation des protéines.

 

e) Les flacons de culture cellulaire simples

La plupart des cellules animales adhérentes ont été cultivées dans des flacons-T depuis leur développement dans les années 40. Ces premiers flacons de culture étaient fait de verre. Cependant les cellules primaires ont du mal à adhérer aux surfaces en verre et donc les scientifiques s’attelaient à la recherche de protéines pouvant améliorer l’adhésion des cellules.

Les flacons et microplaques modernes sont à usage unique, jetable et fait de polystyrène. Le polystyrène est utilisé à cause de ses bonnes propriétés optiques, de sa facilité de fabrication, de son faible coût et des modifications en laboratoire pouvant lui être imposé. Du fait que le polystyrène est naturellement hydrophobe il doit être traité pour devenir hydrophile en lui imposant une décharge électrique partielle. Un traitement alternatif comme l’application de substances de revêtements tels que des matrices protéiques (fibronectine, collagène, laminine, …) peuvent aussi permettre une meilleur adhésion des cellules à la surface des flacons. Les flacons pour la culture cellulaire de cellules adhérentes varient en taille et les versions les plus commercialisés sont les Flacons T25 (25cm2 de surface de culture), T75 et T175. Connaître la surface de culture disponible est essentiel afin de prédire la quantité de cellules nécessaire à l’inoculation du flacon et aussi pour déterminer la production attendue.

T-Flask

Flacon-T au microscope

Les microplaques de culture sont généralement disponibles en versions allant de 6 puits à 386 puits. Leur utilisation est plutôt réservé aux analyses et à la recherche et développement de protéines.

Contrairement aux adhérentes, les flacons pour les cellules en suspensions n’ont pas nécessairement besoin de traitement spécifique.

3. Quel environnement est nécessaire à une culture cellulaire pour proliférer?

a) L’incubateur

Il est important de noter que toute culture cellulaire in vitro ce fait en incubateur. Les flacons ou les bioréacteurs sont placés dans l’incubateur où celui-ci créé un environnement idéal à une température normalement située à 37 °C. D’autres paramètres de l’incubateur sont modulables tels que: l’oxygénation (qui dépendra des types de cellules), l’humidité (généralement de 95% pour éviter l’évaporation du milieu de culture dû au stress osmotique) et la disponibilité en CO2 (normalement de 5% pour maintenir efficacement le pH avec la solution tampon au bicarbonate).

Incubator

Incubateur contenant une Duet Pump FiberCell Hollow Fibre Bioreactor

Les flacons de culture simples tels que les flacons T et les microplaques ne procurent pas un environnement physiologiquement adapté et pertinent aux cellules. En effet les cellules prolifèrent en monocouches 2 dimensionnelles et en condition statique. Le milieu de culture doit être fréquemment changé manuellement ce qui retire des cytokines précieuses. De plus, les surfaces disponibles pour la prolifération de la culture sont limitées et seul de petites quantités de produits sécrétés peuvent être produites. Finalement, si un laboratoire souhaite augmenter sa production, le nombre de flacons T doit augmenter fortement créant une mauvaise optimisation de l’espace dans l’incubateur et augmentant le temps de travail, le nombre de repiquages et les risques de contamination.

b) Les bioréacteurs G-Rex, EZ-Flask et FiberCell: excellentes conditions de culture cellulaire

Un bioréacteur est un appareil offrant un environnement propice et quasi autonome aux cellules pour proliférer. En fonction de leur configuration les différents systèmes de bioréacteurs peuvent être classifiés selon quatre catégories: statique, à vagues, à agitation et à perfusion. La différence majeure se situe dans le transport des produits sécrétés (diffusion, perfusion, émulsification) et de la pertinence de l’appareil soit pour la culture cellulaire adhérente ou en suspension.

Les systèmes EZ-Flask et G-Rex sont des bioréacteurs statiques qui se différencient des T-Flasks grâce à leur membrane d’échange de gaz en silicone située à leur base. Ils permettront de cultiver et de faire proliférer des cellules en suspension de manière quasi autonome sans interventions ni repiquages réguliers. La membrane d’échange de gaz permet d’oxygéner de manière continue la culture par en dessous, ce qui offre la possibilité à l’opérateur de mettre une quantité de milieu beaucoup plus importante dans le flacon.

En effet, le volume de milieu de culture est le facteur le plus limitant avec les Flacons T car s’il y à plus de 3mm (en hauteur) de milieu, l’oxygène présent dans le flacon ne pourra pas se diffuser efficacement et atteindre la culture. De plus, une si petite quantité de milieu nécessite de le changer régulièrement (ce sont les repiquages) pour nourrir et réoxygéner les cellules. Les flacons T sont limités par le fait que leur base est complètement hermétique.

Au contraire, les cellules dans EZ-Flask et les G-Rex Plates sont continuellement oxygénées par dessous ce qui permet d’ajouter autant de milieu de culture que l’on souhaite dans la limite de contenance du flacon. Pour EZ-Flask la contenance est de 1L et pour G-Rex chaque puits peut contenir 35mL. Dans ces systèmes de WilsonWolf les cellules ont une abondance de nutriments et d’oxygène contrairement à d’autres flacons et plaques ne possédant pas la technologie de membrane à échange de gaz. EZ-Flask peut produire jusqu’à 180mg d’anticorps en 30 jours. Les G-Rex Plates sont généralement utilisées pour la recherche et le développement et pour tester différents clones.

Ez-Flask for in vitro monoclonal antibody production

EZ-Flask (1 Litre)

G-Rex plates

G-Rex Plates 6 or 24 Wells

EZ-FlaskMembrane à échange de gaz

Les systèmes FiberCell Hollow Fibre Bioreactor quant à eux sont des bioréacteurs à perfusion. Ce système fonctionne avec une cartouche contenant une grande quantité de fibres creuses et une pompe permettant de faire circuler le milieu. Les cellules prolifèreront autour des fibres et le milieu de culture sera injecté dans la fibre qui ensuite agira comme les capillaires dans le corps. C’est un système in vitro incroyablement biomimétique pouvant produire des grammes d’anticorps monoclonaux en quelques semaines. Ce système peut produire sur une durée de plusieurs mois jusqu’à 1 an.

Hollow fibre bioreactor image

Cartouche à fibres creuses de chez FiberCell Systems

cross-section of fibre

Coupe représentative d’une cartouche FiberCell

culture cellulaire dans fibercell

Système Duet Pump FiberCell Hollow Fiber Bioreactor

Conclusion

KDBIO offre des solutions efficaces pour graduellement augmenter votre productivité en produits sécrétés et pour prendre soin de vos cultures cellulaires. N’hésitez pas à nous contacter si vous avez des questions par rapport à nos produits ou nos services.

Bien cordialement,

L’équipe KDBIO

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